Метод твердой фазы - Автоматический синтез белков - Молекулы и клетки - Мед Читалка

Метод твердой фазы

Надо полагать, что для синтеза таких больших и сложных молекул, какими являются белки, нужны более простые и эффективные методы. В 1959 г. был задуман новый подход к синтезу пептидов. Идея состояла в том, чтобы синтезировать длинные цепи путем добавления каждый раз одной аминокислоты, но без выделения промежуточных пептидов; для осуществления этой идеи планировалось прикреплять цепь к нерастворимой твердой основе.

Порядок добавления аминокислот для метода твердой фазы

По замыслу первая аминокислота должна быть связана с твердой частицей, а остальные аминокислоты должны добавляться по очереди в нужном порядке. Поскольку твердая основа совершенно нерастворима в большинстве растворителей, все промежуточные пептиды также останутся в нерастворимом состоянии; значит, для их очистки достаточно просто растворить нежелательные побочные продукты и реагенты и несколько раз промыть осадок.

Дело сводится к элементарному фильтрованию, но по существу этот способ очистки равнозначен классической перекристаллизации: растущий пептид остается в нерастворимом осадке, а нежелательные реагенты попадают в раствор.

Фильтрование

Фильтрование как метод очистки гораздо легче и быстрее. Еще важнее то, что фильтрование всегда проводится одинаково, тогда как кристаллизация в каждом отдельном случае индивидуальна и каждый новый промежуточный пептид требует своей методики кристаллизации.

Схема пептидного синтеза в твердой фазе

В общих чертах схема пептидного синтеза в твердой фазе довольно проста. Выбирается подходящая твердая основа, и к ее поверхности прикрепляется реакционноспособный центр. Первая аминокислота — ей, кстати, предстоит стать концевой аминокислотой синтезируемой нами пептидной цепи — прикрепляется к реакционноспособному центру своей карбоксильной группой. Вторая аминокислота, у которой заблокированы все группы, кроме одной, активируется и присоединяется к первой. Теперь с подпоркой связан дипептид, причем все его реакционноспособные группы защищены. Твердый компонент собирают фильтрованием и тщательно промывают, чтобы удалить избыток реагентов и побочные продукты; эта операция проводится без малейшего риска потерять нужный пептид.

На следующей стадии снимается защита с концевой аминогруппы и весь процесс повторяется точно таким же образом, но теперь уже с новой аминокислотой.


«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка