Получения пептида из смолы в опытах А. Марглин

Используя 3 грамма смолы, А. Марглин смог приготовить около 2 граммов препарата защищенной А-цепи. На 8 граммах смолы удалось получить 8 граммов пептида, который был идентичен В-цепи. Снятие пептидной цепи с полистирольной основы заодно приводило к удалению большей части защитных групп с боковых цепей; оставались только бензильные группы, связанные с боковыми цепями цистеина и гистидина. Эти группы можно было удалить восстановленным металлическим натрием, растворенным в жидком аммиаке. Эту реакцию уже довольно давно открыл В. дю Виньо. Она и послужила решающим звеном в осуществленном дю Виньо историческом синтезе гормонов гипофиза — окситоцина и вазопрессина.

Однако, когда мы попытались применить обработку натрием в своей работе с инсулином, это вначале сопровождалось разрушением некоторых связей между аминокислотами треонином и пролином в В-цепи. Как только мы поняли причину, мы смогли тщательно подобрать условия реакции, и в конце концов нам удалось предотвратить расщепление.

После такого снятия защиты цистеиновые группы оставались в восстановленной SH-форме. Хотя именно такая форма нам и нужна для последней реакции окисления, когда происходит объединение цепей, однако сами SH-группы очень неустойчивы и потому перед очисткой препарата нам приходилось их стабилизировать, превращая в S-сульфонаты (SSО3-). Теперь можно было приступить к очистке обеих пептидных цепей. Для этой цели использовались три метода: фильтрование, основанное на различиях в размерах молекул; противоточное распределение, основанное на различиях в растворимости, и, наконец, электрофорез в свободном потоке, основанный на различиях в электрическом заряде молекул. Полученные продукты можно было испытать на гомогенность, используя другие электрофоретические и хроматографические критерии. Как было подтверждено с помощью аминокислотного анализа, очищенные цепи имели состав, характерный для А- и В-цепей инсулина.

Последняя стадия синтеза инсулина — объединение двух очищенных цепей. Но для этого надо вновь перевести цистеинсульфонаты в SH-форму. Лишь после этого происходит объединение цепей. Здесь мы воспользовались методикой, разработанной китайскими химиками, которая состоит в медленном окислении на воздухе SH-групн обеих цепей (смотрите рисунок ниже).


Объединение очищенных А- и В-цепей в сульфонатной форме

Объединение очищенных А- и В-цепей в сульфонатной форме

Осуществляется оно с помощью метода, разработанного китайскими химиками. А- и В-цепи смешивают и обрабатывают тиогликолевой кислотой, которая восстанавливает цистеиновые остатки, переводя их обратно в сульфгидрильную форму. На воздухе в щелочном растворе сульфгидрильные группы медленно окисляются и образуются три дисульфидные связи, характерные для природного инсулина. Побочные продукты, образовавшиеся в результате неправильного соединения цистеиновых остатков, можно удалить путем экстракции.


Сначала мы удостоверились в том, что каждая из синтезированных нами цепей может объединяться с комплементарной природной цепью, образуя, если так можно сказать, полусинтетический инсулин, обладающий биологической активностью. Затем мы провели объединение двух синтетических цепей. Активность синтетического гормона определяли стандартным биологическим методом. Ее оценивают по количеству препарата, которое нужно ввести лабораторным мышам, для того чтобы у 50% животных вызвать гипогликемические судороги.

Подобная реакция наблюдалась и после введения синтетического препарата, причем она была следствием именно низкого содержания сахара в крови, а не была обусловлена каким- то неспецифическим токсическим эффектом, так как после введения глюкозы состояние животных быстро нормализовалось. Применялись также различного рода физические и химические тесты, но и здесь синтетический препарат вел себя аналогично природному инсулину. Так, например, его подвижность при электрофорезе на бумаге такая же, как и у природного гормона.

Выходы пептидных цепей и степень их чистоты получаются достаточно высокими. Однако что касается объединения цепей, то здесь выход все еще невысок. Важный шаг вперед в этом отношении был сделан недавно Кацояннисом и его сотрудниками. Они несколько изменили процедуру, первоначально разработанную китайскими химиками, и стали использовать SH-форму А-цепи и SSO3-форму В-цепи. В результате на конечной стадии синтеза стали получать более приемлемые выходы. Теперь мы с полным правом можем сказать, что по крайней мере один белок мы синтезировать умеем. В своем стремлении повторить природу химики взяли еще один барьер.


«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка

Вперед →