Хромосома ДНК - Синтез ДНК - Молекулы и клетки - Мед Читалка

Хромосома ДНК

В хромосоме ДНК представляет собой линейную последовательность многих генов. В свою очередь каждый ген соответствует цепочке примерно из 1000 нуклеотидов, чередующихся в точно заданной последовательности; эта последовательность, переведенная в последовательность аминокислот, должна обеспечить построение определенного фермента или другого белка.

Спрашивается: если синтез ДНК идет в пробирке, то насколько аккуратно работает ДНК-полимераза в этих условиях? Насколько точно она воспроизводит комплементарную последовательность нуклеотидов и не делает ли она при этом пропусков, вставок, перестановок? К сожалению, пока нет метода, который бы позволил устанавливать точную последовательность нуклеотидов даже в коротких фрагментах ДНК.

Поэтому непосредственно прочитать последовательность оснований в природной ДНК и сравнить ее с последовательностью в полученной нами копии мы не можем. Для оценки точности воспроизведения матричной ДНК приходится обращаться к другим методам. Один из них — это «анализ ближайших соседей», а другой — воспроизведение генов, имеющих четко выраженную биологическую активность.

Анализ ближайших соседей

Метод анализа ближайших соседей, который Дж. Джоссе, А. Кайзер и я ввели в практику в 1959 г., состоит в определении относительной частоты появления в молекуле синтетической ДНК двух заданных нуклеотидов рядом друг с другом. Всего имеется 16 возможных комбинаций: четыре соседа могут быть у А (АА, АГ, AT, АЦ), четыре —у Г (ГА, ГГ, ГТ, ГЦ) и по четыре — у Т и Ц. Как же определить, с какой частотой в синтетической ДНК появляется та или иная динуклеотидная последовательность? Для этой цели в ходе синтеза используется трифосфат, помеченный радиоактивным фосфором, а после синтеза специальным ферментом новая ДНК расщепляется так, чтобы радиоактивный фосфор попал к ближайшему нуклеотиду. Пусть, например, синтез ДНК идет при участии А*, у которого помечена внутренняя фосфатная группа; эта группа должна войти в состав синтезированного продукта. Там она образует нормальную связь с нуклеотидом, стоящим в цепи непосредственно перед А (смотрите рисунок ниже).


«Анализ ближайших соседей» позволяет сказать, сколь часто расположены рядом
любые два из четырех оснований синтетической ДНК

«Анализ ближайших соседей» позволяет сказать, сколь часто расположены рядом любые два из четырех оснований синтетической ДНК

Таким образом, можно определить, как часто вслед за А идет А, Т, Г или Ц и т. д. В один из активированных нуклеотидов (например, А*) вводится радиоактивный атом фосфора (красный). По окончании синтеза ДНК обрабатывают ферментом, который разрывает цепь между каждым фосфатом и 5'-атомом углерода соседнего остатка дезоксирибозы. В результате фосфат отделяется от нуклеотида, которому он принадлежал до образования цепи, и оказывается в составе ближайшего соседнего нуклеотида (в данном случае нуклеотида Ц). Четыре сорта нуклеотидов разделяют с помощью хроматографии на бумаге, а затем измеряют радиоактивность каждой фракции. Далее радиоактивный фосфор вводится в другой активированный нуклеотид, и эксперимент повторяется.


На каждый опыт образуется около 1016 таких связей! Затем новую ДНК выделяют и подвергают ферментативному расщеплению, причем фермент разрывает связь между атомом углерода 5´-дезоксирибозы и фосфатом. Теперь радиоактивный фосфор оказывается уже не у А, а у соседнего нуклеотида.


«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка