Главная / Молекулы и клетки / Синтез ДНК / Препятствия при воспроизведении замкнутой ДНК

Препятствия при воспроизведении замкнутой ДНК

Еще только принимаясь за воспроизведение замкнутой ДНК, мы могли предвидеть ряд серьезных препятствий. Каким образом ДНК-полимераза найдет ориентацию, нужную для репликации матричной ДНК, если эта ДНК не имеет концов? Ш. Митра, а позднее П. Рейчард сумели подобрать условия, при которых, судя по электронным микрофотографиям, фермент может вести копирование такой одноцепочечной петли. В этот период мы не были уверены даже в том, что ДНК фага ⌀X174 действительно замкнута.

Вид замкнутых петель на электронных микрофотографиях еще ничего не доказывал. Например, некоторые исследователи высказывали предположение, что цепь вирусной ДНК замыкается специальным зажимом, а зажим состоит не из нуклеотидов, а из каких-то других соединений, которых в наших бесклеточных системах могло и не быть. В то же время, согласно работам Синсхеймера, ДНК фага ⌀X174 обладает инфекционностью лишь в тех случаях, когда она имеет форму замкнутой петли. А наша полимераза, как мы знали, могла вести синтез только линейных молекул ДНК. Как же тогда быть с синтезом замкнутых петлеобразных молекул? Либо нас подведет отсутствие компонента, играющего роль зажима, либо, если гипотеза насчет зажима неверна, нам будет нехватать фермента, замыкающего петлю ДНК.

К счастью, недостающий фактор мы все-таки нашли, и этим мы обязаны работе, проводившейся независимо в пяти разных лабораториях. В 1966 г. был открыт фермент, способный соединять полинуклеотидные цепи, причем о его открытии почти одновременно сообщили М. Геллерт и его сотрудники, Р. Вейсс и Б. Вейсс, Д. Хервиц и его коллеги, Леман и Б. Оливера, а также мой сотрудник Н. Кодзарелли. В настоящее время мы используем препарат Лемана — Оливеры.

Найденный фермент обладает способностью устранять «обрывы» цепи ДНК. Строго говоря, обрывы устраняются лишь в тех случаях, когда они встречаются только в одной цепи ДНК и сводятся к разрыву ковалентной связи между сахаром и соседним фосфатом. Теперь, имея в руках «за-мыкающий» фермент, мы могли испробовать его вместе с ДНК-полимеразой для синтеза кольцевой биологически активной фаговой ДНК.

Работа с ДНК фага ⌀X174 дала нам одно важное преимущество, которого бы мы не имели в экспериментах по трансформирующей активности. Даже если бы нам удалось синтезировать ДНК, обладающую трансформирующей активностью, ценность этого результата была бы сравнительно невелика. Мы могли бы тогда сказать, что ограниченный участок ДНК, размеры которого меньше гена, заменил в хромосоме клетки-реципиента такой же участок цепи, и в результате клетка приобрела недостающий ей признак. Но Синсхеймер показал, что если в ДНК фага ⌀X174 заменить даже один из 5500 нуклеотидов, то этого достаточно, чтобы фаг утратил свою инфекционность.

Следовательно, если бы нам удалось получить инфекционную синтетическую ДНК, то мы могли бы с полным правом сказать, что провели практически безошибочный синтез ДНК, состоящей из большого числа нуклеотидов, которые вместе составляют пять или шесть генов, ответственных за биологические функции фага.

«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка

Популярные статьи раздела