Метод отделения синтетических линейных форм от синтетических кольцевых

Для отделения синтетических линейных форм от синтетических кольцевых применялся другой физический метод, основанный на седиментации в градиенте плотности. Затем кольцевые формы испытывались на инфекционность согласно тестам, разработанным Синсхеймером для оценки инфекционности кольцевой ДНК фага ⌀X174.

Мы инкубировали наши кольца (—) с клетками Е. coli, оболочки которых были предварительно разрушены ферментом лизоцимом. Инфекционность оценивалась по способности фага лизировать (растворять) такие же клетки после их высевания на питательную среду. Как выяснилось, синтетические петли обладали почти такой же инфекционностью, что и их природные собратья. Так была продемонстрирована биологическая активность синтетической ДНК.

Оставалось провести еще одну серию экспериментов, в которых синтетические петли (—) должны были играть роль матриц; в этом случае ставилась цель получить полностью синтетические двойные кольцевые формы, аналогичные репликативным формам, обнаруженным в клетках, зараженных природным фагом 0X174.

Поскольку синтетические петли (—) уже были помечены радиоактивным фосфором, мы метили нуклеотидный материал (Ц*) тритием. Остальные операции проводились практически так же, как уже было описано; в результате были получены полностью синтетические двойные кольца фага ⌀X174. Выделенные из них петли ( + ) оказались во всех отношениях идентичными петлям (+) природного фага. И с инфекционностью все было в порядке. Ранее Синсхеймер на основе тех же тестов показал, что изменение в одном нуклеотиде приводит к возникновению мутантов, инфекционность которых много меньше нормы. Следовательно, соответствие в уровне инфекционности между нашими синтетическими формами и их природными собратьями говорит о том, что точность нашего синтеза достаточна для воспроизведения ферментативных функций.

Дальнейшие перспективы

Синтез инфекционной фаговой ДНК из четырех дезоксинуклеозидтри- фосфатов с помощью ДНК-полимеразы, помимо того, что он демонстрирует способность этого фермента безошибочно воспроизводить малую хромосому (из 5—6 генов), еще указывает на то, что по крайней мере эта хромосома действительно представляет собой линейную последовательность четырех стандартных дезоксинуклеотидов. Отсюда до хромосомы человека, которая примерно в 10 000 раз больше, еще очень и очень далеко, и тем не менее мы отваживаемся обобщать наши представления о составе и структуре полинуклеотидных цепей крошечной хромосомы фага ⌀X174, распространяя их на хромосомы более крупные.


«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка

← Назад
Вперед →