Химическое фракционирование фактора F1
Путем химического фракционирования фактора F1 мы получали чистый фермент с хорошим выходом. Вначале даже казалось, что выход слишком высок: часто число единиц АТФ-азной активности в конечном препарате превышало то, которое по нашим оценкам должен был содержать исходный, неочищенный препарат. Кроме того, отношение эффективности сопряжения к АТФ-азной активности в ходе очистки не было постоянным. Пульман исследовал эти расхождения и показал, что неочищенный митохондриальный экстракт, помимо всего прочего, содержал белок, снижавший (ингибировавший) АТФ-азную активность, не затрагивая при этом механизм сопряжения. В процессе очистки этот белок удалялся, что и объясняло неожиданное возрастание суммарной АТФ-азной активности.
Очищенный фактор F1 имел одно совершенно непонятное свойство. Ларди со своими сотрудниками показал, что окислительное фосфорилирование, равно как и АТФ-азная активность митохондрий, очень чувствительно к действию олигомицина. В то же время на наш растворимый фермент тот же олигомицин никакого влияния не оказывал. Это явное расхождение дало повод некоторым нашим коллегам усомниться в значении наших наблюдений над растворимым ферментом. Я слышал, как покойный О. Эвери однажды заметил: «То, что вы упали, не имеет большого значения; важно, чтобы вы успели что-нибудь прихватить с полу». Нам оставалось только принять вызов и попытаться разгадать, почему олигомицин снижает ферментативную активность митохондриальных частиц, но не действует на растворимый фермент.
Мы начали с рабочей гипотезы. Мы предположили, что в митохондриях присутствует какой-то особый компонент, который «наделяет» фермент чувствительностью к олигомицину. Для того чтобы это показать, нам нужно было сначала приготовить препарат субмитохондриальных частиц, удалить из него всю связанную АТФ-азу, чувствительную к олигомицину, затем добавить фактор Fi и посмотреть, что получится.
Нам удавалось убрать всю АТФ-азную активность частиц, обрабатывая их мочевиной при 0°, но, к нашему удивлению, по мере хранения препарата или при его разбавлении чувствительная к олигомицину АТФ-азная активность появлялась снова. Мы были вынуждены заключить, что в субмитохондриальных частицах АТФ-аза находится преимущественно в скрытом виде (должно «быть, ее активность подавляет ингибитор Пульмана), причем эта АТФ-аза более устойчива к действию мочевины по сравнению с обычной, незаблокированной АТФ-азой. Теперь нашей задачей было выявить присутствие скрытой АТФ-азы, удаляя ингибитор еще до обработки частиц мочевиной.
«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка
Популярные статьи раздела
- Результат, получаемый при использовании неповрежденных митохондрий
- Роль фактора сопряжения
- Двойственная роль фактора F1
- Аллотопические свойства фермента
- Эксперименты по выделению фактора F1
- Образование АТФ
- Фактор сопряжения F4
- Ферменты, катализирующие процессы переноса электронов
- Получение частиц утративших всю АТФ-азную активность
- Дыхательные ферменты в сферических частицах
