Внедрение техники молекулярного клонирования
Дальнейший успех исследований, посвященных обоснованию существования онкогенов, был связан с внедрением техники молекулярного клонирования. В экспериментах по трансфекции клонированных участков провируса саркомы мышей (MSV) было четко показано, что трансформирующим эффектом обладал лишь вектор, содержащий онкоген [Blair D. G. et al., 1980].
Идентичные результаты получены в экспериментах с микроинъекциями клонированных онкогенов. Существенно, что прямое введение онкогена RSV цыплятам приводило в течение 4 нед к образованию опухолей. Этот процесс сопровождался увеличением синтеза мРНК, специфичной для онкогена.
Введенный онкоген интегрировался в ДНК генома клетки независимо от наличия в нем других эндогенных вирусных последовательностей. Интересно, что возникающие в этих случаях опухоли имели моно- или поликлональное происхождение [Fung Y. et al., 1982].
Включение онкогенных последовательностей в вирусный геном, вероятно, главным образом обусловливается рекомбинациями последовательностей клеточных аналогов онкогенов с геномом вируса. Об этом прежде всего свидетельствует факт высокой степени рекомбинаций ретровирусов с геномом клетки и включений фрагментов клеточной ДНК в вирусный геном, что приводит к образованию рекомбинантной генетической информации, ответственной за трансформацию клеток [Wang L. Н. et al., 1979; Rapp U. R., 1980].
Не менее убедительные данные были получены на некоторых частично дефектных по гену src ptd-мутантных RSV, которые, вызывая опухоли у цыплят, восстанавливали свою трансформирующую активность также за счет рекомбинантных процессов.
Такие варианты RSV получили название rRSV (recover RSV). Обычно у этих частично делеционных мутантов ASV (ptd-ASV) сохранялось не менее 7 % последовательностей гена src. При сравнительном исследовании rASV было установлено, что онкоген (ген src) у них восстанавливается за счет клеточных последовательностей, т. е. в результате включения клеточного аналога гена src (протоонкогена) в геном вируса.
Вместе с тем, по данным фингерпринтного анализа, полная идентичность в генах src между вирусом дикого типа и rRSV отсутствует. Показано также, что src-последовательности в восстановленных вирусах сарком птиц rASV идентичны для вирусов одного вида птиц и отличаются от src-последовательностей rASV других видов птиц. Сравнение олигонуклеотидных карт разных типов td-мутантов свидетельствует о том, что для восстановления трансформирующего потенциала необходимо наличие фрагмента гена src на З´-конце этого гена.
Один из td-мутантов, имеющий мутацию, затрагивающую не только 5´-область src, но и З´-область env, был способен к генерации rRSV с полным онкогеном (геном src), однако с делециями в генах env или даже в env и pol.
Это обстоятельство указывает на то, что один из фрагментов генома в td-варианте, который необходим для рекомбинации с клеточным аналогом онкогена, находится на границе src и env, а другие подобные участки локализованы на границах между генами gag и pol, pol и env, внутри гена pol [Wang L. Н. et al., 1979; Hanafusa F. et al., 1980].
«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко
