Структура, физико-химическая и биологическая характеристика онкобелков - «Мед Читалка»

Структура, физико-химическая и биологическая характеристика онкобелков

Большинство современных способов обнаружения и идентификации онкобелков — продуктов трансформирующих генов ретровирусов — основывается на иммунологических методиках. При этом стандартные подходы могут быть не всегда эффективны, поскольку, во-первых, онкогены ретровирусов, как отмечалось выше, являются неструктурными генами и их продукты не включаются в состав зрелых вирусных частиц. Во-вторых, в зависимости от типа гена (независимые или слитные) онкобелки содержат или только уникальные антигенные детерминанты, или как уникальные, так и антигенные детерминанты, специфичные для определенных, структурных генов вирусного генома, например, гена gag. Учитывая это, к настоящему времени разработано пять методических подходов, позволяющих идентифицировать онкобелки.

  1. Использование сывороток животных с новообразованиями, вызванными ретровирусами. С помощью сыворотки от кроликов с опухолью, индуцированной RSV, были обнаружены антитела, реагирующие с продуктом гена src — pp60src [Brugge J. S. et al, 1977, 1979; Oppermann H. et al, 1979]. Наиболее высокий титр антител, как правило, наблюдался у животных с регрессирующими новообразованиями. Причем такие сыворотки обычно содержали антитела и к структурным белкам вириона, поэтому этим способом можно определять в основном продукты независимых онкогенов.
  2. Определение онкобелков слитных трансформирующих генов с использованием для этой цели моноспецифических сывороток к отдельным структурным белкам гена gag, поскольку продукты слитных онкогенов содержат антигенные детерминанты gag-белков. С помощью этого методического приема были идентифицированы практически все продукты слитных онкогенов.
  3. Использование гибридомной техники для получения моноклональных антител к продуктам онкогенов. Например, М. Е. Furth и соавт. (1982) получили 8 гибридных клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела к продукту гена ras вирусов Ki-MSV и Ha-MSV — р21. К настоящему времени моноклональные антитела получены к многим трансформирующим и структурным белкам ретровирусов и, в частности, к pp60src RSV [Parsons S. J. et al., 1983; Tanaka T. et al., 1983].
  4. Создание бесклеточной белоксинтезирующей тест-системы in vitro, в которой транслируют исследуемую вирионную РНК. В такой системе при наличии соответствующих сывороток четко идентифицируются как структурные, так и неструктурные белки, в том числе и продукты онкогенов [Sefton В. М. et al., 1979].
  5. Последний подход базируется на знании первичной структуры онкогенов, что позволяет осуществлять синтез пептидов, соответствующих различным фрагментам онкобелков и таким способом выявлять участки, которые несут антигенные детерминанты. В случае продуктов онкогенов эта задача несколько упрощается, так как известно, что по крайней мере одна из антигенных детерминант этих белков связана с тирозином, который подвергается аутофосфорилированию.

Таким способом был, например, получен пептид гена fes из 9 аминокислот (в центре находился тирозин), который затем конъюгировали с белком-носителем. С помощью сыворотки, полученной после иммунизации кроликов этим комплексом, в трансформированных ST-FeSV клетках обнаружили P85gag-fes — продукт гена fes [Essex М., 1982].

Аналогичный прием был использован для идентификации продукта гена mos
— p37mos (теоретически рассчитанного на основании известной нуклеотидной последовательности онкогена mos) — с помощью сыворотки к синтетическому пептиду, соответствующему СООН-концевым 12 аминокислотам этого белка [Рарkoff J. et al., 1982]. Поскольку при применении такой сыворотки выявлялись некоторые неспецифические белки, с помощью дополнительных методик из M-MSV трансформированных клеток, меченных 35[5]-метионином, и применяя указанную сыворотку, был преципитирован р37.

По данным фингерпринтного анализа этот белок оказался идентичным р37, который синтезировался в системе бесклеточной трансляции РНК M-MSV штамм 124. Количество p37mos в трансформированных клетках было крайне низким — 0,0002 % — 0,0008 % от тотального количества клеточного белка (10 000 — 40 000 молекул на клетку), что на несколько порядков ниже, чем для трансформирующих белков других ретровирусов.

Отмечается высокая эффективность метода получения антител к синтетическим пептидам и других онкобелков, в частности, к pp60src и p28sis [Devare S. G. et al, 1983; Tamura T. et al, 1983].


«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко