Регуляторные элементы SV40
Определенный интерес представляют регуляторные элементы SV40, контролирующие и регулирующие транскрипцию и репликацию. В последующем такие регуляторные генетические элементы (ES-последовательности) были обнаружены и у других ДНК- и РНК-содержащих опухолеродных вирусов.
У SV40 регуляторная зона представляет собой тандемный повтор, каждый из 72 пар оснований. Она расположена на расстоянии 115 оснований против часовой стрелки от точки начала транскрипции ранней мРНК, т. е. в участках, соответствующих промоторам ранних и поздних генов [Gruss Р. et al., 1981; Dynan W, Tjian R, 1982]. Такие контрольные элементы способны усиливать транскрипцию клеточных генов более чем в 200 раз. Необходимым условием является структурное положение ES-последовательностей в одной молекуле ДНК с контролируемым геном (цис-действующий элемент).
Эффект сохраняется независимо от ориентации, т. е. спереди или сзади гена находятся эти последовательности на расстоянии не менее 3000 п. н. Получены данные, подтверждающие модель активации и стимуляции ранней и поздней транскрипции повтором в 72 пары оснований по двум направлениям [Wasylyk В. et al., 1983; Vigneron М. et al., 1984].
Третьим принципиально важным процессом, который удалось связать с функцией гена А паповавирусов, является активация синтеза клеточной ДНК. В прямых опытах с микроинъекциями в клетки ранней мРНК SV40 было показано, что через несколько часов после появления в таких клетках Т-антигена происходит синтез клеточной ДНК.
Следовательно, ранние мРНК SV40 содержат информацию, обеспечивающую синтез Т-антигена и стимуляцию репликации хроматина клетки [Graessmann A, Graessmann М, 1976]. Аналогичные данные при добавлении Т-антигена к изолированным ядрам клеток были получены М. А. Шлянкевичем и соавт. (1977).
В последующем подтвердилось, что при микроинъекции интактной ДНК SV40, ранней РНК SV40, а также Т-антигена происходит экспрессия различных вирусных функций: стимуляция синтеза клеточной ДНК, индукция репликаций вирусной ДНК, уменьшение актиновых волокон, трансформация клеток. Причем более точное картирование вирусных функций было проведено при помощи микроинъекции различных рестрикционных фрагментов ДНК SV40 [Graessmann А, Graessmann М, 1983].
Тщательный отбор и исследование свойств ранних ts-мутантов паповавирусов позволили разделить две функции — инициацию стабильной трансформации и поддержание трансформированного фенотипа — между двумя разными областями раннего гена опухолеродного вируса [Eckhart W, 1969; Kimura G., Dulbecco R., 1973]. В последующем в экспериментах на ts-мутантах паповавирусов удалось определить самостоятельную митогенную функцию (стимуляцию клеточного деления) и тесно связать три функции гена А (инициацию синтеза вирусной ДНК, осуществление интеграции вирусного и клеточного геномов, регуляцию транскрипции ранних и поздних вирусных генов).
На основании этих данных была выдвинута гипотеза о «плейотропных эффекторах», которая основывалась на предположении о том, что различные детерминанты2 Т-антигена обладают разной функциональной специфичностью и, взаимодействуя с вирусными и клеточными регуляторными компонентами, вызывают те или иные эффекты.
В частности, инициируют плейотропные модуляции клетки; некоторые из них необходимы для репродукции вируса. Вскоре были получены ts-мутанты SV40 и делеционные мутанты SVR9D, у которых дефектна функция синтеза вирусной ДНК, однако они обладали способностью трансформировать клетки, т. е. эти экспериментальные факты подтвердили предположение R. Weil и соавт. [Gluzman Y. et al., 1977; Stringer J. R, 1982].
Генетически мутация SVR9D представляет собой замену аденина на гуанин в положении 4178, что обусловливает замену лизина на глутамин в положении 214 в мутантном полипептиде Т-антигена. Однако в системе вирусов PY были отобраны ts-мутанты, дефектные по способности трансформировать клетки, но сохранившие способность репликации вируса [Eckhart W, 1977].
Эти мутанты четко отличались от ts-A-мутантов, которые могли поддерживать состояние трансформации при непермиссивной температуре, но не осуществляли стабильную трансформацию и репликацию вирусной ДНК. В результате было установлено, что одна из зон Т-антигена обусловливает трансформацию, другая ответственна за репликацию, транскрипцию и интеграцию вирусной ДНК [Weinberg R, 1977]. Т-Антиген может активировать синтез клеточной ДНК опосредованно. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что для этого необходимо участие и клеточного компонента [Hiscott J. В., Defendi V, 1981].
Итак, возникает принципиальный вопрос: осуществляются ли две основные функции вирусного генома — интеграция вирусного и клеточного геномов, а также активация синтеза ДНК вируса и клетки — разными ранними белками или они связаны с различными зонами одного белка — Т-антигена.
Транскрипция гена А начинается в точке 0,67 ед. карты вирусного генома (за точку 0 принимают строго определенное место разрыва рестриктазой EcoRI кольцевой молекулы ДНК SV40) и заканчивается в точке 0,16. Матричная РНК этого гена в полисомах определяется в виде ранней 19S РНК (5´-конец ее молекулы соответствует 0,57 — 0,59, а З´-конец — 0,16 ед. карты).
Ген А, вероятно, кодирует три ранних белка: Т-антиген, TSTA3 (tumor specific transplantation antigen — опухолевый специфический трансплантационный антиген с ММ 55 000 — 58 000) и U-антиген (ММ 28 000 — 30 000), ассоциированный с ядерным матриксом [Deppert W., 1980; Deppert W. et al., 1980].
2 Антигенные детерминанты — поверхностно расположенные химические группы, играющие определенную роль в иммунологической специфичности антигенов.
3 TSTA-антигены, ответственные за противоопухолевый иммунитет, т. е. определяют иммунный ответ организма на клетки, трансформировнные опухолеродным вирусом.
«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко
Популярные статьи раздела
