Анализ субклеточной локализации среднего Т-антигена

Анализ субклеточной локализации среднего Т-антигена
Т. Hunter и соавт. (1980), использовав экспериментальные и теоретические разработки, составили схему, согласно которой три ранних антигена вируса PY кодируются перекрывающимися последовательностями ДНК вируса PY. Все три белка имеют общую NH2-концевую часть (80 аминокислотных остатков), кодируемую в трансляционной фазе 2 в области 74 — 79 ед. карты.

Малый и средний Т-антигены, кроме того, имеют общие 120 аминокислот, кодируемые в рамке 2 в области 79 — 85 ед. карты, которых нет в большом Т-антигене. С-Концевая часть среднего Т-антигена, состоящая из 230 аминокислот, картируется в фазе 1 между 86 и 99 ед. карты. Остальная часть большого Т-антигена кодируется в фазе 3 между 86 и 25 ед. карты, перекрываясь с С-концевой областью среднего Т-антигена.

Анализ субклеточной локализации среднего Т-антигена вируса PY (иммунофлюоресценция, иммунная электронная микроскопия и применение моноклональных антител) показал, что он ассоциирован с цитоплазматическими мембранами. На ранних стадиях инфекции основная часть среднего Т-антигена обнаруживается в комплексе с эндоплазматическим ретикулумом. Небольшое количество этого белка выявляется на плазменных мембранах клетки. На поздних этапах инфекции доля среднего Т-антигена вируса PY на плазменной мембране возрастает [Dilworth S. М., Griffin В. Е., 1983].

Все формы Т-антигена содержат фосфорные группы, обновляющиеся несколько раз в течение жизни белка. Путем картирования пептидов, полученных в результате частичного протеолиза, и анализа фосфоаминокислот в этих пептидах были исследованы сайты фосфорилирования в большом Т-антигене SV40.

Идентифицировано 6 основных фосфопептидов и определено их распределение внутри протеолитических фрагментов Т-А-антигена SV40 [Roy F. et al., 1983; Scheidtmann К. H. et al., 1981, 1982]. NH2-Концевая часть молекулы содержит три фосфосерина и один фосфотреонин в зоне с 81-го по 124-й аминокислотный остаток.

Все 4 фосфоаминокислоты расположены между Ser106 и Tre124. С-Концевая зона, обогащенная по пролину, также содержит три фосфосерина, расположенных ближе к центру молекулы в положении 500 — 640 и один фосфотреонин, локализованный в положении либо 701, либо 708. В мутанте SV40 dl 1265, дефектном в отношении хелперных функций для аденовируса, этот сайт отсутствует. Показано, что через 24 ч инкубации 93 % указанных пептидов содержат фосфотреонин. Метаболизм фосфатных остатков, ассоциированных с серином, осуществляется быстро (в течение 5 — 6 ч), тогда как фосфор, связанный с остатком треонина, метаболизирует значительно медленнее.

Из клеток, трансформированных SV40 или пермиссивных4 и непермиссивных, зараженных этим вирусом, выделено несколько молекулярных форм Т-антигена и при сравнительном анализе не обнаружено принципиальных различий в фосфорилировании Т-А-антигена SV40 в трансформированных клетках. Не было получено никаких экспериментальных доказательств в пользу того, что в составе большого Т-антигена SV40 имеются фосфорилированные остатки тирозина.

Итак, нельзя исключить, что у Т-А-антигена SV40, обладающего плейотропным эффектом, функционально активные формы могут различаться по степени фосфорилирования, иными словами этот белок фосфорилируется дифференцированно.

В пользу этого свидетельствуют следующие факты.

  1. Большой Т-антиген фосфорилирован во многих сайтах, причем обратимо, и все фосфопептиды отличаются по содержанию фосфора.
  2. Существует корреляция между уровнем фосфорилирования и олигомеризации Т-антигена.
  3. Более фосфорилированный Т-антиген активнее связывается с ДНК, т. е. данный белок фосфорилирован в клетке в разной степени и это влияет на его сродство к вирусной ДНК и клеточному хроматину и ДНК [Montenarh М. et al., 1980; Scheidtmann К. Н. et al., 1982]. Однако фосфорилирование Т-антигена не требуется для стимуляции синтеза клеточной ДНК [Rawlins D. R. et al., 1983].

4 Пермиссивные клетки — это клетки, в которых вирус может пройти полный репродуктивный цикл.


«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко

← Назад
Вперед →