Компоненты среднего Т-антигена вируса PY

В клетках, литически инфицированных вирусом PY или трансформированных этим вирусом с применением метода иммунопреципитации, было обнаружено два типа среднего Т-антигена, обладающего протеинкиназной активностью [Schaffhansen В., Benjamin Т. L., 1981].

Минорный компонент с молекулярной массой 58 000, составляющий 10 % от общего количества среднего Т-антигена, был более чем в 10 раз активнее в качестве акцептора фосфатных групп по сравнению с основным компонентом с молекулярной массой 56 000.

По данным частичного протеолитического расщепления в этих компонентах фосфорилируется один и тот же сайт. Результаты картирования среднего Т-антигена с помощью различных делеционных мутантов свидетельствуют о том, что фосфорилированию подвергается тирозин в положении 315. In vivo также наблюдается фосфорилирование обоих компонентов среднего Т-антигена вируса PY.

Каждый компонент содержит небольшое количество фосфотирозина и фосфотреонина и существенно большее количество фосфосерина. Следовательно, in vivo указанные компоненты отличаются по профилю фосфорилирования от таковых в системе in vitro. Некоторое количество фосфата включается in vivo в компонент с молекулярной массой 58 000 в тот участок, который обусловливает различия между белками с массой 58 000 и 56 000.

Hr-t-мутант mg59 вируса PY, который кодирует незначительно измененный средний Т-антиген, продуцирует только компонент с массой 58 000, который не активен в киназной реакции in vitro. Предполагают, что средний Т-антиген вируса PY, локализованный в мембране, представляет собой активную тирозинкиназу.

Т. Hunter и соавт. (1984) исследовали сайты фосфорилирования данного антигена в двух системах:
либо в составе иммунопреципитатного комплекса, либо в системе in vitro после очистки этого белка методом афинной хроматографии.

Оказалось, что среди 15 тирозиновых остатков, имеющихся в составе антигена, два, находящиеся в положении 250 и 315, подвергаются наиболее интенсивному фосфорилированию. Эти результаты подтверждены в опытах с использованием нескольких мутантов, имеющих делецию по этим участкам среднего Т-антигена вируса PY.

Если к иммунопреципитатам, содержащим этот антиген, добавляли синтетический декапептид, по структуре сходный с аминокислотной последовательностью вокруг тирозина в положении 315 (сам тирозин при этом локализован в центре этого пептида), то этот декапептид также подвергался фосфорилированию. Отмечено увеличение фосфорилирования по тирозину среднего Т-антигена вируса PY под действием ЭФР, что указывает на определенную связь между ними [Segawa К., По Y., 1983]. Показано, что основной сайт (положение тирозина 315) фосфорилирования в среднем Т-антигене вируса PY не является необходимым для проявления трансформирующей способности вируса [Mes-Massoii А. М. et al., 1984].

В то же время оказалось, что некоторые вирусные протеинкиназы в процессе неопластического перерождения клетки могут функционировать в комплексе с фосфоиротеинкиназами — продуктами клеточных онкогенов. Например, обнаружен комплекс среднего Т-антигена вируса PY, обладающий киназной активностью, с pp60c-src, который, как считают, модифицирует активность и специфичность протеинкиназы pp60c-src при трансформации клеток этим вирусом [Smith А. Е. et al., 1983; Courtneidge S. A, Smith A. E., 1984].

Выявлена АТФазная активность только у большого Т-антигена полиомавирусов [Clark R. et al., 1981]. Эта активность не повышалась в присутствии денатурированной ДНК и ингибировалась при добавлении сыворотки против Т-антигена. Получены данные, свидетельствующие о том, что АТФазная активность Т-А-антигена SV40 кодируется участком гена A SV40 между 0,37 и 0,29 ед. генетической карты.

Разработан тест определения этой активности с использованием моноклональных антител, существенно не ингибирующих АТФазную активность Т-антигена SV40. С помощью теста можно выявлять низкие уровни Т-антигена в экстрактах клеток, зараженных SV40. Кроме того, Т-антиген стимулирует включение 32[Р] из у-32[Р]-АТФ в белок [Griffin J. D. et al., 1979].

По результатам электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), субстратом фосфорилирования служит Т-А-антиген. Кроме того, высокоочищенный Т-антиген стимулировал включение фосфата в экзогенный акцептор — казеин. При многостадийной очистке наблюдались параллельное обогащение препарата Т-А-антигеном и возрастание активности протеинкиназы, причем при седиментации оба компонента обнаруживались в зоне 6S.

Активность протеинкиназы препарата Т-антигена ts-мутанта SV40 характеризуется повышенной термолабильностью.

Следовательно, Т-антиген обладает еще двумя ферментативными активностями: АТФазной и протеинкиназной, которые ингибируются сывороткой против Т-антигена [Hand R, 1981].

В инфицированных и трансформированных вирусом SV40 клетках ДНК-полимеразная активность соосаждается с основной массой Т-антигена SV40 матрикса и копреципитируется антисывороткой к Т-антигену [Jones С, Su R. Т, 1982].

Предполагают, что между ассоциированной с матриксом ДНК-полимеразой и Т-антигеном SV40 образуется комплекс. Получены доказательства того, что полипептид VP1, вируса PY является сериновой протеазой, которая функционирует в процессе внутриклеточного «раздевания» вируса [Bowen J. Н. et al., 1984].


«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко

← Назад
Вперед →