Клеточный фосфобелок р53

С помощью сывороток, содержащих моноклональные антитела против Т-антигенов SV40, были обнаружены индивидуальные подклассы большого Т-антигена и сходство между невирусными клеточными белками с молекулярной массой 48 000 — 60 000. Они обозначены р53.

Оказалось, что эти опухолеассоциированные клеточные белки, появляющиеся в клетках (различного видового происхождения), трансформированных другими ДНК- и РНК-содержащими опухолеродными вирусами, химическими канцерогенами, в спонтаннотрансформированных клетках, а также в клетках различных опухолей человека сходны (или идентичны).

Белок р53 из всех перечисленных трансформированных клеток осаждается антисывороткой к Т-антигену SV40. Это свидетельствует о том, что все указанные опухолеассоциированные белки имеют по крайней мере одну общую антигенную детерминанту [Adkins В. et al., 1982; Lipsich L. A. et al., 1982; Sarnow P. et al., 1982; Thomas R. et al., 1983; Leppard K. N., Crawford С. V., 1984, и др.].

Фосфопротеид p53 является консервативным, стадиоспецифическим эмбриональным белком, так как он синтезируется на ранних стадиях эмбриогенеза [Mora Р. Т. et al., 1980]. Установлено, что для индукции синтеза р53 необходим синтез специфической мРНК и синтез этого белка происходит в течение первых 4 ч после индукции митогеном [Milner J., Milner S., 1981].

Поскольку эта величина коррелирует со временем, необходимым для перехода клеток в репликативный цикл, предполагают, что р53 активируется в процессе перехода из фазы G₀ в фазу G₁. Считают, что в норме р53 активируется в периоды высокой пролиферативной активности клеток и регулирует репликацию ДНК.

Доказано, что вновь синтезируемые в цитоплазме Т-антиген SV40 и р53 независимо мигрируют в ядро, при этом р53 мигрирует туда с несколько большей скоростью, чем Т-антиген, и уже в ядре формирует стабильный комплекс со зрелой формой Т-A-антигема SV40 и с супер-Т-антигеном SV40 [McCormick F., Harlow Е., 1980; Clayton С. et al., 1982; Schmieg F. I., Simmons D. Т., 1984].

Образование комплекса происходит достаточно быстро (в пределах 5 — 30 мин) и зависит от соотношения Т-антигена SV40 и р53. В этом комплексе обнаружено только два белка — Т-А-антиген и р53, причем оба белка соединены нековалентными связями. В трансформированных клетках комплекс локализован в ядре и на клеточной поверхности. Т-Антиген в составе комплекса фосфорилируется с большей скоростью, чем в свободной форме.

Определен минимальный фрагмент Т-А-антигена SV40, который необходим для связывания с р53. Им оказался полипептид с молекулярной массой 40 000; его синтез начинается в точке 0,40 ед. генетической карты ДНК SV40. р53 образует комплекс с Т-антигеном, коэффициент седиментации которого равен 23 — 25S, в то время как интактный Т-антиген обнаруживается в зоне 14 — 16S. Комплекс р53 — Т-антиген обладал различной стабильностью в исследованных клеточных линиях и, кроме того, каждая линия характеризуется разным соотношением р53 и Т-антигена в свободном состоянии и в виде комплекса [Fanning Е. et al., 1981].

Сначала комплекс р53 — Т-антиген был выявлен в трансформированных SV40 и непермиссивных клетках, зараженных этим вирусом. Причем р53 осаждался сывороткой как к большому, так и малому Т-антигену [Rundell К., Yang Y. С., 1981].

При продуктивной инфекции (в клетках обезьян) этот комплекс с помощью иммунопреципитации обнаружить не удавалось до тех пор, пока не были использованы сыворотки, содержащие высокий титр антител к Т-А-антигену, а также моноклональные антитела против р53.

Таким способом было показано, что комплекс р53 — Т-антиген образуется и в литически инфицированных клетках обезьян, но при этом в комплекс вступает лишь незначительная часть Т-А-антигена и такой комплекс осаждается в градиенте плотности сахарозы в зоне 20S.

Комплекс 20S осаждается как антителами к большому Т-антигену, так и моноклональными антителами к р53. Инфекция клеток обезьян сопровождается 5-кратным увеличением скорости синтеза р53 по сравнению с таковой в незараженных клетках, а степень фосфорилирования р53 возрастает в 30 раз [Harlow Е. et al., 1981].

В трансформированных SV40 клетках, содержащих Т-антиген, экспрессия р53 возрастала в 10 — 20 раз. В Т-антиген-отрицательных (Т^—) ревертантных опухолевых линиях и клонах клеток, полученных путем иммунологической селекции in vivo, содержались небольшие количества р53, как и в исходных родительских клонах.

Во всех Т^—-клонах, включая и высокоонкогенные, происходило быстрое разрушение р53: период полураспада составлял 15 — 60 мин. Напротив, во всех Т⁺-клонах р53 оказался стабильным (период полураспада равен 10 ч). Корреляция между количеством р53 и туморогенностью трансформированных клеток отсутствовала [Mora Р. Т. et al., 1982]. Вместе с тем полагают, что образование комплекса р53 — Т-антиген является первой фазой вирусной трансформации клеток.

Для исследования созревания комплекса р53 — Т-антиген использовали различные методические приемы: подавление агрегации, ингибирование процессинга мутациями в локусе А, иммунопреципитацию с помощью моноклональных антител к Т-антигену и р53. Обнаружено существование специфических стадий в реакциях, приводящих к образованию быстро седиментирующего олигомерного комплекса.

При импульсной метке (³[Н]-метионином и ³²[Р]-ортофосфатом) в течение 30 мин комплекс седиментировал при 5 — 6S, а при длительной метке (22 ч) — при 24S, т. е. образование комплекса происходит при увеличении фосфорилирования Т-антигена. При анализе мышиных фибробластов, трансформированных ts-мутантом А58 SV40 (мутация в локусе A SV40), наблюдалось снижение фосфорилирования Т-антигена, седиментации Т-антигена (главным образом при 5 — 6S) и связывания с р53. Следовательно, мутации в локусе А приводят к подавлению формирования из вновь синтезируемого Т-антигена и р53 олигомерных комплексов.

Показано, что вновь синтезируемый Т-антиген, определяемый с помощью антиопухолевой сыворотки, претерпевает последовательные изменения, приобретая реактивность в реакции с моноклональными антителами, специфичными к антигенным детерминантам зрелого Т-антигена, а затем в результате образования комплекса с р53 приобретает способность преципитироваться моноклональными антителами к антигенным детерминантам р53 [Greenspan D. S, Carroll R. В., 1981; Carroll R. В, Gurney E. G, 1982].

«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко

Популярные статьи раздела