Специфичность и молекулярные механизмы интеграции

Анализ и сопоставление физических карт линейного интегрированнного и неинтегрированного ДНК-провирусов ретровирусов позволили установить, что процесс интеграции ретровирусного и клеточного геномов является строго специфичным относительно провирусной ДНК.

Дело в том, что при интеграции не происходит никаких изменений последовательностей фрагментов вирусного генома и интегрированные провирусы строго колинеарны продукту обратной транскрипции [Hughes S. Н, et al., 1978, 1981; Souza L. et al., 1980; Bacheler L, Fan H, 1981|.

У всех интегрированных ДНК-провирусов выявлены характерные особенности, которые отличают их от неинтегрированных провирусных геномов.

  1. В процессе интеграции утрачиваются 1 — 2 концевых нуклеотида, входящие в инвертированные повторы LTR; у всех исследованных ретровирусов утрачивались динуклеотиды ТТ.
  2. Интегрированный проретровирус оканчивается динуклеотидами ТГ… ЦА.
  3. Интегрированный ДНК-провирус всегда имеет два LTR в отличие от неинтегрированного, который может быть и с одним LTR.
  4. В зависимости от вида ретровируса короткая клеточная последовательность (1 — 6 нуклеотидов) непосредственно в месте внедрения вирусного генома удваивается, образуя по краям провируса короткие прямые повторы [Hughes S. Н. et al., 1981; Skalka А. М. et al., 1981; Temin H. M., 1981].

Причем в некоторых случаях было показано, что эти повторы не предшествуют, а образуются de novo.

С помощью анализа клеточных последовательностей ДНК также установлено, что нуклеотидный состав этих повторов варьирует от клона к клону. Это свидетельствует об отсутствии строгой специфичности места интеграции ретровирусных провирусов по отношению к определенным последовательностям на клеточной ДНК.

Действительно, огромный фактический материал, полученный в экспериментах на тест-системах различных ретровирусов, указывает на присутствие в клеточной ДНК множественных мест интеграции вирусного генома [Hughes S. Н. et al., 1981; Lerner Т. L. et al., 1981; Kettman A. et al., 1983; Gudkov A. V. et al., 1983; Tsutsui K. et al., 1983, и др.]. Предполагают, что интеграция вирусных последовательностей происходит как в транскрипционно-активные, так и неактивные участки клеточного генома.

Уместно вспомнить, что у некоторых транспозонов при их встраивании также не удалось обнаружить специфичности относительно клеточных нуклеотидных последовательностей. Вместе с тем в том и в другом случае с помощью генетического анализа в геноме клетки обнаружены локусы, вероятность интеграции в которые значительно выше (или же осуществляется только в эти места), чем в остальные участки генома.

Например, локус Revi, локализованный на хромосоме 6 в клетках человека, идентифицирован как преимущественное место интеграции ретровируса павианов в геноме клеток человека [O´Brien S. et al., 1980].

Установлено также, что провирус RSV интегрирует в уникальные последовательности ДНК клеток крыс и может присутствовать только в одной из двух гомологичных хромосом [Hughes S. Н. et al., 1981]. В геноме клеток мышей идентифицирован интегративный сайт MMTV-intI, внутри которого встраивается провирус MTV в различных опухолях молочных желез. Этот участок содержит фрагмент, который транскрибируется в поли-А+-РНК в опухолях молочных желез [Nusse R, Varmus Н. Е, 1983].

Во всех опухолях, в которых провирус интегрирован в MMTV-intI, с этого участка транскрибируется РНК размером 2,6 кб, за исключением некоторых опухолей, где провирус интегрирован в непосредственной близости от транскрипционного участка. В таком случае транскрибируется более длинный транскрипт. Это свидетельствует о том, что сайт интеграции определяет размер транскрипта. Предполагают, что участок MMTV-intI активно участвует в канцерогенезе, индуцированным MTV, путем экспрессии нового клеточного онкогена.

В реинфицированных клетках была выявлена тандемная интеграция ретровирусов птиц [Carloni S. et al., 1980]. Показано, что при реинтеграции провируса встраивание чаще осуществляется в участки, в которых уже интегрированы вирусные последовательности [Etrind P. R., Sarkar N. H., 1983].

Таким образом, несмотря на полное отсутствие специфичности интеграции относительно клеточных последовательностей, еще не ясно, все ли участки ДНК клетки являются одинаково вероятными для встраивания проретровирусов. По-видимому, широкое использование гибридизации in situ, позволяющей локализовать уникальные гены непосредственно на препаратах хромосом, даст возможность разобраться в этом вопросе.

Механизм физической интеграции вирусной и клеточной ДНК практически не исследован, особенно плохо изучены последовательные промежуточные этапы этого процесса. До сих пор центральное место в этой проблеме принадлежит прежде всего исследованию механизмов, которые ограничивают число копий интегрированных провирусов.

Не выяснено также, какая из форм провируса является непосредственным предшественником интегрированного провируса, что обусловливает колинеарность интегрированных и свободных ДНК провирусов.

Ничего неизвестно о вирусных и клеточных факторах, ферментных системах, осуществляющих рекомбинации вирусного и клеточного геномов. Не получены также мутанты, дефектные по интеграции. Установлено лишь, что активация репарационных систем не влияет на множественность интеграции.

Вместе с тем многочисленные косвенные факты и аналоги с эписомами, профагами и транспозонами позволяют предполагать, что кольцевые провирусы являются наиболее вероятными предшественниками интегрированных вирусных геномов. В этом отношении определенный интерес представляет частично фосфорилированный белок рр32, происходящий из β-субъединицы обратной транскриптазы [Misra Т. К. et al., 1982].

Считают, что рр32 в основном связывается с двумя соседствующими инвертированными повторами на границе U5 и U3 в LTR, т. е. в том сегменте, который участвует в циркуляризации линейной ДНК и, очевидно, представляет собой сайт, осуществляющий интеграцию в клеточную ДНК. На различных моделях ретровирусов было показано, что рестрикционные карты интегрированной и неинтегрированной вирусной ДНК идентичны [Battula N. et al., 1980; Souza L. et al., 1980; Hughes S. H. et al., 1981].

Этот факт свидетельствует о наличии специфичного сайта интеграции в области терминальных повторов. Таким образом, если специфичность в отношении клеточного генома отсутствовала, то всегда имела место специфичность для вирусной ДНК, которая связывается клеточной в пределах концевых повторяющихся последовательностей длиной около 330 нуклеотидов.


«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко

← Назад
Вперед →