Методы изготовления аллергенов из папиллом

Мы совместно, с. И. В. Рагозиной при консультации Е. И. Гудковой впервые разработали методы изготовления тканевых аллергенов из папиллом. Была проведена проверка активности полученного аллергена в эксперименте на животных и уточнена их аллергенная активность при внутрикожном введении и иммунологическом обследовании сыворотки крови больных папилломами.

Тканевые аллергены из папиллом были приготовлены двумя методами:

  1. путем водно-солевого экстрагирования;
  2. фракционирования при помощи кислотного и алкогольного гидролиза.

Изготовление аллергена из папиллом методом водно-солевого экстрагирования. Ткань папилломы промывали физиологическим раствором, подсушивали через фильтровальную бумагу, взвешивали, заливали раствором антибиотиков (300 000 ЕД пенициллина и 500 000 ЕД стрептомицина) для обезвреживания ткани от микроорганизмов и ставили на сутки в холодильник.

Затем отмывали ткань физиологическим раствором от антибиотиков, измельчали ножницами, растирали в ступке со стерильным кварцевым песком. К растертой смеси добавляли физиологический раствор в соотношении 1:10 (рН должен быть равен 7,5 — 8,0) и помещали на сутки в холодильник. Затем кипятили на водяной бане в течение 5 мин, охлаждали, полученную взвесь центрифугировали в течение 15 мин при 3500 об/мин.

Надосадочную жидкость фильтровали через стерильную бактериальную свечу, проверяли на стерильность, а затем разливали в ампулы и автоклавировали при 1,5 атм в течение 15 мин. После проверки на стерильность и токсичность экстракт был пригоден к употреблению в качестве аллергена.

Изготовление аллергена из папиллом путем фракционирования:

  • фракция А — нуклеопротеидная,
  • фракция В — полисахаридная.

Получение белковой фракции аллергена: ткань папилломы обрабатывали так же, как при водно-солевом экстрагировании. Измельченную ткань заливали физиологическим раствором в соотношении 1:3 к весу ткани, рН эмульсии устанавливали равным 8,0 с помощью 0,2% раствора едкого натра, ставили на сутки в холодильник. Через сутки проверяли рН 8,0 и при необходимости подщелачивали.

Затем центрифугировали в холодильной центрифуге в течение 15 мин при 4000 об/мин. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость подкисляли 20% раствором уксусной кислоты до рН 4,0 — 4,2 и ставили в холодильник.

На следующие сутки из раствора вновь выпадал осадок, который собирали путем центрифугирования, неоднократно промывали подкисленной до рН 4,0 — 4,2 дистиллированной водой, растворяли в 0,01 едкого натра к первоначальному объему в отношении 1:3 и устанавливали рН 7,2. Кипятили на водяной бане в течение 5 мин и разливали в ампулы.

Получение полисахаридной фракции аллергена:
надосадочную кислотную жидкость, оставшуюся после осаждения белковой фракции, выпаривали на водяной бане до 4/10 первоначального объема заливали 10 объемами этилового спирта, после чего получался осадок. Осадок промывали на бумажном фильтре равным объемом спирта и высушивали в ацетоне. Затем осадок растворяли в 6аратном буфере рН 8,1 или в жидкости Кока; доводили рН аллергена до 7,2 — 7,3 и разливали в ампулы.

Исходя из того, что папилломы вызываются вирусом, который термостабилен и разрушается только при 70° после 30-минутного прогревания, мы обе фракции автоклавировали при 1,5 атм в течение 15 мин. Производились пробы на стерильность исходного материала и готовых аллергенов, они показали отсутствие бактериального загрязнения; обе фракции аллергенов также проверяли на токсичность и безвредность.

В каждой серии белковой фракции аллергена определялось содержание общего и остаточного азота по методу микро-Кьельдаля. Обычно количество общего азота колебалось в пределах 93,8 — 105 мг%, а после пересчета на белок концентрация по азотному белку отдельных серий аллергена составляла 6 — 8 мг/мл. Прежде чем приступить к постановке кожных проб с изготовленными аллергенами у больных папилломами, мы провели экспериментальные исследования.


«Папилломы верхних дыхательных путей»,
И.А.Вознесенская

← Назад
Вперед →