Хромосома ДНК

В хромосоме ДНК представляет собой линейную последовательность многих генов. В свою очередь каждый ген соответствует цепочке примерно из 1000 нуклеотидов, чередующихся в точно заданной последовательности; эта последовательность, переведенная в последовательность аминокислот, должна обеспечить построение определенного фермента или другого белка.

Спрашивается: если синтез ДНК идет в пробирке, то насколько аккуратно работает ДНК-полимераза в этих условиях? Насколько точно она воспроизводит комплементарную последовательность нуклеотидов и не делает ли она при этом пропусков, вставок, перестановок? К сожалению, пока нет метода, который бы позволил устанавливать точную последовательность нуклеотидов даже в коротких фрагментах ДНК.

Поэтому непосредственно прочитать последовательность оснований в природной ДНК и сравнить ее с последовательностью в полученной нами копии мы не можем. Для оценки точности воспроизведения матричной ДНК приходится обращаться к другим методам. Один из них — это «анализ ближайших соседей», а другой — воспроизведение генов, имеющих четко выраженную биологическую активность.

Анализ ближайших соседей

Метод анализа ближайших соседей, который Дж. Джоссе, А. Кайзер и я ввели в практику в 1959 г., состоит в определении относительной частоты появления в молекуле синтетической ДНК двух заданных нуклеотидов рядом друг с другом. Всего имеется 16 возможных комбинаций: четыре соседа могут быть у А (АА, АГ, AT, АЦ), четыре —у Г (ГА, ГГ, ГТ, ГЦ) и по четыре — у Т и Ц. Как же определить, с какой частотой в синтетической ДНК появляется та или иная динуклеотидная последовательность? Для этой цели в ходе синтеза используется трифосфат, помеченный радиоактивным фосфором, а после синтеза специальным ферментом новая ДНК расщепляется так, чтобы радиоактивный фосфор попал к ближайшему нуклеотиду. Пусть, например, синтез ДНК идет при участии А*, у которого помечена внутренняя фосфатная группа; эта группа должна войти в состав синтезированного продукта. Там она образует нормальную связь с нуклеотидом, стоящим в цепи непосредственно перед А (смотрите рисунок ниже).

«Анализ ближайших соседей» позволяет сказать, сколь часто расположены рядом
любые два из четырех оснований синтетической ДНК

Таким образом, можно определить, как часто вслед за А идет А, Т, Г или Ц и т. д. В один из активированных нуклеотидов (например, А*) вводится радиоактивный атом фосфора (красный). По окончании синтеза ДНК обрабатывают ферментом, который разрывает цепь между каждым фосфатом и 5'-атомом углерода соседнего остатка дезоксирибозы. В результате фосфат отделяется от нуклеотида, которому он принадлежал до образования цепи, и оказывается в составе ближайшего соседнего нуклеотида (в данном случае нуклеотида Ц). Четыре сорта нуклеотидов разделяют с помощью хроматографии на бумаге, а затем измеряют радиоактивность каждой фракции. Далее радиоактивный фосфор вводится в другой активированный нуклеотид, и эксперимент повторяется.

На каждый опыт образуется около 1016 таких связей! Затем новую ДНК выделяют и подвергают ферментативному расщеплению, причем фермент разрывает связь между атомом углерода 5´-дезоксирибозы и фосфатом. Теперь радиоактивный фосфор оказывается уже не у А, а у соседнего нуклеотида.

«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка

Популярные статьи раздела

• Синтез в пробирке ДНК фага ⌀X174
• Строение замкнутых петлей ДНК
• Метод отделения синтетических линейных форм от синтетических кольцевых
• Химический остов и физическая структура синтетической ДНК
• Разделение нуклеотидов распавшейся ДНК
• Трудности воспроизведения биологически активной ДНК
• Предыстория
• Последовательность реакций распада
• Дезоксирибозные звенья в двойной спирали ДНК
• Методы синтеза нуклеиновой кислоты