Трудности воспроизведения биологически активной ДНК

Трудности воспроизведения биологически активной ДНК частично были связаны с тем, что наши препараты ДНК-полимеразы всегда содержали следовые количества нуклеаз. Нуклеазами называются ферменты, разрушающие ДНК. Если нуклеаза разорвет длинную цепь ДНК хотя бы в одном месте, этого будет достаточно для полной потери генетической активности. Пришлось снова взяться за очистку ДНК-полимеразы. Ч. Ричардсон, Т. Джовин, П. Энглунд и Л. Бертш бились над этой проблемой несколько лет и в конце концов нашли новый, очень простой и эффективный метод очистки. И вот в апреле 1967 г. мы получили из 100 килограммов бактериальной пасты из Е. coli около 0,5 грамма чистого фермента, совершенно свободного от нуклеаз. Теперь случайных разрывов в цепи ДНК можно было не бояться.

К сожалению, даже и такая высокоочищенная ДНК-полимераза не могла синтезировать биологически активный материал на бактериальной матричной ДНК. Мы думаем, что ДНК, экстрагированная из бактерий, оказывается не очень удачной матрицей для фермента.

Самая подходящая матрица для построения ДНК

Самой подходящей матрицей была бы природная хромосома — двуспиральная кольцевая структура общей длиной около миллиметра. Но такие хромосомы в процессе выделения ломаются, и при этом получается около 100 мелких фрагментов. Действие ДНК-полимеразы и других ферментов во время репликации таких крупных и сложных молекул, как хромосома В. subtilis, в настоящее время изучается во многих лабораториях.

Фаг ⌀ Х174

Как-то нам пришло в голову, что синтез биологически активной ДНК будет легче осуществить, если в качестве матрицы взять более простую форму ДНК, тоже обладающую генетической активностью. Такую ДНК нам предоставляют вирусы, в частности фаг ⌀X174, ДНК которого имеет вид одноцепочечной петли. «Хромосома» эта не только проще по структуре, но и гораздо меньше (около двух микрон по длине кольца); ее вполне можно выделить, не опасаясь никаких разрывов.

По работам Р. Синсхеймера мы знали, что ДНК фага ⌀X174 сразу после внедрения в клетку Е. coli заставляет один из ферментов клетки-хозяина катализировать превращение одноцепочечной петли в петлеобразную двойную спираль. Продукт этой стадии заражения Синсхеймер назвал репликативной формой. Вполне возможно, что фермент, копирующий фаговую ДНК, как раз и есть та ДНК-полимераза, которую мы выделяли из клеток Е. coli.

«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка

Популярные статьи раздела

• Метод отделения синтетических линейных форм от синтетических кольцевых
• Синтез в пробирке ДНК фага ⌀X174
• Строение замкнутых петлей ДНК
• Химический остов и физическая структура синтетической ДНК
• Хромосома ДНК
• Разделение нуклеотидов распавшейся ДНК
• Предыстория
• Последовательность реакций распада
• Дезоксирибозные звенья в двойной спирали ДНК
• Методы синтеза нуклеиновой кислоты