Строение замкнутых петлей ДНК


Три замкнутые петли ДНК (X 200 000)

Три замкнутые петли ДНК (X 200 000)

Все три петли сложены из двух спирально скрученных цепей, одна из которых представляет собой природную одноцепочечную ДНК бактериофага ⌀X174, а вторая — комплементарную цепь синтетической ДНК. Синтез второй цепи осуществлялся в пробирке с помощью фермента; матрицей служила ДНК фага ⌀X174. Гибридные молекулы биологически активны. Каждая петля содержит около 5500 пар оснований.


Относительно зажимов из ненуклеотидного материала, замыкающих фаговую ДНК, уже можно было не вспоминать; стало ясно, что никаких таких зажимов в действительности не существует.

Осталось решить два самых важных вопроса. Во-первых, нужно было выяснить: имеют ли синтетические кольца биологическую активность — обладают ли они инфекционностью? И второй вопрос: могут ли полученные кольца в свою очередь служить матрицами для образования полностью синтетической двойной ДНК, аналогичной репликативным формам, которые образуются внутри клеток при их естественном заражении? Чтобы ответить на первый вопрос, нам пришлось выделить синтетические цепи ДНК из наполовину синтетических двойных колец. По причинам, указанным ниже, мы брали для синтеза не тимин, а его синтетический биологически активный аналог бромурацил (см. рис. 2).

Смотрите рисунок – Составные части ДНК: четыре вида оснований, дезоксирибоза (сахар) и простой фосфат

Для выделения синтетической ДНК мы проводили кратковременную обработку препарата нуклеазой; количество нуклеазы подбиралось так, чтобы примерно у половины молекул произошел один обрыв в одной цепи. В результате таких обрывов из двойных колец начинали освобождаться линейные цепи ДНК, которые путем нагревания можно было отделить от кольцевых одноцепочечных молекул и от незатронутых двойных колец. В итоге получалась смесь, содержащая в равных количествах матричные петли (+), синтетические петли (—), матричные линейные формы ( + ) и синтетические линейные формы (—); здесь же были и двойные кольца, не имевшие обрывов.

Теперь настало время воспользоваться присутствием бромурацила. Бромурацил отличается от тимина тем, что вместо метильной группы содержит атом брома; это делает его значительно тяжелее тимина. Поэтому молекулы с бромурацилом можно отделить от молекул с тимином путем центрифугирования с очень высокой скоростью в тяжелом солевом растворе (метод градиента плотности, усовершенствованный Д. Виноградом). В этих условиях вещество с большей плотностью будет располагаться ближе к дну кюветы центрифуги.

Следовательно, у нас в верхней части кюветы были фракции, содержавшие легкие цепи тиминовой ДНК ( + ), ниже находились гибридные двойные петли промежуточной плотности и, наконец, ниже всех оказывались цепи синтетической ДНК (—), «утяжеленные» бромурацилом. Эффективность такого фракционирования подтверждалась наличием трех отдельных пиков радиоактивности, соответствовавших каждой из фракций. Наша уверенность еще более окрепла, когда оказалось, что средняя плотность каждой фракции в точности совпадает со средней плотностью стандартных образцов фаговой ДНК, содержащих бромурацил или тимин.


«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка