Синтез в пробирке ДНК фага ⌀X174 - Синтез ДНК - Молекулы и клетки - Мед Читалка

Синтез в пробирке ДНК фага ⌀X174

Синтез в пробирке ДНК фага ⌀X174 (смотрите рисунок ниже) занял у нас меньше года.


Синтез ДНК фага ⌀X174

Синтез ДНК фага ⌀X174

Кольцевая одноцепочечная ДНК фага 0X174, меченная тритием, служит матрицей (1). К матрице добавляют активированные нуклеотиды, содержащие основания А, Г и Ц, а вместо Т добавляют нуклеотид, содержащий 5´-бромурацил. Вместе с нуклеотидами добавляют также ДНК-полимеразу. Один из активированных нуклеотидов метят радиоактивным фосфором. ДНК, синтезированная на матрице, получается незамкнутой (2). Для замыкания нужен специальный фермент (3). Далее добавляют нуклеазу в таком количестве, чтобы произошел обрыв одной из цепей в половине образовавшихся кольцевых двойных молекул (4). Образуется смесь полных двойных колец, матричных колец, синтетических колец, линейных матричных цепей и линейных синтетических цепей. Так как синтетические цепи содержат 5´-бромурацил, они тяжелее матричных и могут быть отделены от них центрифугированием (5). Синтетические петли выделяют и используют в качестве матрицы для синтеза полностью синтетических двойных замкнутых молекул (6 и 7).


Весь процесс состоял из следующих этапов. Из фага ⌀X174 была выделена служившая матрицей ДНК, помеченная тритием — радиоактивным изотопом водорода. Тритий играл роль метки, по которой мы судили о присутствии ДНК-матрицы. К ДНК-матрице добавляли ДНК-полимеразу, очищенный замыкающий фермент и кофермент (дифосфопиридиннуклеотид), а также А*, Т*, Г* и Ц*. Один из нуклеозидтрифосфатов содержал радиоактивный фосфор, который служил меткой синтетического продукта. Взаимодействие всех этих реагентов продолжалось до тех пор, пока количество полимеризованных нуклеотидов не становилось в точности равным количеству нуклеотидов в матричной ДНК. Момент такого выравнивания легко определить, сопоставляя радиоактивность трития и фосфора.

Когда этот момент наступал, мы считали, что уже прошло достаточно времени для того, чтобы образовались комплементарные цепи синтетической ДНК. Комплементарные кольцевые структуры мы обозначали знаком (—), чтобы отличать их от матричных ( + ). Теперь нам нужно было показать, что синтетические структуры действительно замкнуты. Могло ведь случиться, что полимераза еще не завершила полный оборот вокруг матрицы, а замыкающий фермент еще не успел соединить оба конца цепи.

Однако после ряда физических измерений, в том числе электронно-микроскопических, мы убедились, что наш продукт представляет собой замкнутую петлю, туго закрученную вокруг ДНК-матрицы, причем по размерам и другим признакам он полностью соответствует репликативной форме ДНК, появляющейся в зараженных клетках (смотрите рисунок ниже).

Смотрите рисунок — Три замкнутые петли ДНК (X 200 000)


«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка