Синтез ДНК в бесклеточной системе

Когда мы впервые попытались добиться синтеза ДНК в бесклеточной системе, мы взяли дезоксирибонуклеозид, известный как дезокситимидин. Меченый дезокситимидин мы получили от М. Фридкина, который к тому же сообщил нам, что это соединение легко включается в ДНК клеток костного мозга и других животных клеток. Мы надеялись, что экстракты из клеток Е. coli сначала превратят дезокситимидин в 5´-дезоксинуклеотид, а затем переведут его в активированную трифосфатную форму, после чего нуклеотид будет включен в состав нуклеиновой кислоты. Вскоре я убедился, что это и происходит в действительности (смотрите рисунок ниже).


Синтез ДНК представляет собой ступенчатое присоединение
активированных нуклеотидов к растущей полимерной цепи

Синтез ДНК представляет собой ступенчатое присоединение активированных нуклеотидов к растущей полимерной цепи

Здесь показано присоединение к цепи дезоксиаденозин-5´-трифосфата (А*), которое идет путем образованияфосфодиэфирной связи между атомом углерода 3´ дезоксирибозы последнего нуклеотида цепи и атомом углерода 5´ в дезоксирибозе нового мономера цепи.


В последующие месяцы Э. Симмс и я отдельно готовили дезокситимидин-5´-трифосфат и другие дезоксинуклеозидтрифосфаты, используя для этой цели ферменты и различные химические методы. (Далее в тексте различные дезоксинуклеозиды в их трифосфатной форме я буду просто обозначать первой буквой соответствующего основания со звездочкой вверху. Например, дезокситимидин-5´-трифосфат будет обозначаться Т*.)

В ноябре 1955 г. Р. Леман приступил к очистке из экстрактов Е. coli ферментной системы, которая была бы способна превращать Т* в ДНК. Через несколько недель к нам присоединился М. Бессман. В те дни, полные волнующих событий, мы шаг за шагом приближались к заветной цели — очистке нового фермента, позднее названного ДНК-полимеразой. С каждым новым этапом очистки фермента от других больших молекул реакции синтеза ДНК шли все более четко. В июне 1956 г. мы приняли участие в конференции по химическим основам наследственности; на этой конференции мы уже могли сообщить два важных факта, относящихся к синтезу ДНК in vitro, хотя на многие другие важные вопросы ответа у нас не имелось.

Во-первых, мы сообщили, что для синтеза ДНК, помимо ДНК-полимеразы, требуется присутствие некоторого количества готовой ДНК; кроме того, нужно обязательно добавлять все четыре дезоксинуклеотида (А, Г, Т и Ц), причем каждый из них должен быть взят в активированной (три- фосфатной) форме. Во-вторых, нам было ясно, что при использовании фермента из Е. coli ДНК можно брать практически из любого источника: из вирусов, бактерий, животных. Тогда мы еще не знали, является ли синтезированная ДНК новой молекулой или она служит продолжением старой ДНК. Были и другие вопросы.

Смотрите далее — Химический остов и физическая структура синтетической ДНК


«Молекулы и клетки», под ред. акад. Г.М.Франка