Ретровирусспецифическая фосфопротеинкиназная активность, как правило, обладает способностью аутофосфорилирования онкобелка и фосфорилирования некоторых гетерогенных субстратов. Как уже отмечалось, в системе in vitro в исходном трансформирующем белке фосфорилированию в основном подвергается тирозин, в меньшей степени серин, а иногда и треонин.
Установлено, что из гетерогенных белков, помимо тяжелых цепей иммуноглобулина (поскольку реакция проводится в иммунных комплексах), фосфорилированию может подвергаться лишь несколько белков. Тестирование проводилось путем внесения исследуемых белков в систему фосфорилирования иммунных комплексов.
Оказалось, что, кроме α-казеина, в этой системе фосфорилировалось два белка, осуществляющих центральные функции в структурной организации клетки (ее цитоскелета): основной белок микрофиламентов актин и основной белок микротрубочек тубулин [Hunter Т. et al., 1981; Ito S. et al., 1982].
Было также показано, что наиболее хорошо изученные трансмембранные антигены гистосовместимости клеток человека (HLA-A2 и HLA-B7) и родственные им антигены комплекса гистосовместимости мышей фосфорилируются in vitro по остатку тирозина, кодируемому высококонсервативным экзоном внутриклеточного домена [Guild A. et al, 1983]. Это указывает на важность функции данного участка антигенов, возможно модифицируемых при фосфорилировании.
Гораздо сложнее обнаружить белки, которые фосфорилируются в процессе трансформации клеток. Работ, проведенных в этом направлении, пока явно недостаточно и все такие эксперименты выполнялись главным образом на системе куриных фибробластов трансформированных RSV.
В большинстве этих исследований для анализа фосфобелков использовали метод фракционирования в полиакриламидных гелях (ПААГ), содержащих додецилсульфат натрия. Следует отметить, что этот метод имеет меньшую разрешающую способность по сравнению с методом двумерного распределения белков.
Указанным способом было установлено, что в нормальных клетках кур, меченных в течение нескольких часов 32[Р], лишь около 0,03 % фосфорилированных аминокислот в белках представлено фосфотирозином. В трансформированных RSV клетках уровень фосфорилирования увеличивался в 6 — 10 раз [Beemon К. et al, 1982].
В последующих опытах на фибробластах кур, трансформированных RSV и инкубированных с γ-32[Р]-АТФ, с помощью двумерного электрофореза в ПААГ было идентифицировано несколько белков, возможных субстратов фосфорилирования по тирозину pp60src: виметин, филамин, винкулин (они являются компонентами цитоскелета) и белков с молекулярной массой 36 000, 48 000 и 55 000 [Kobayashi N. et al, 1981; Maltzman W. et al, 1981; Sefton В. M. et al, 1982].
Анализ фосфоаминокислот, входящих в состав фосфорилированного белка с молекулярной массой 36 000, показал, что его фосфорилирование происходит исключительно по тирозину. Причем, по данным двумерного электрофореза в ПААГ, белки с такой массой in vitro и in vivo не отличались друг от друга.
В фибробластах, трансформированных td-мутантом RSV ts-NY468 и культивированных при непермиссивной температуре, не наблюдали фосфорилирования белка с массой 36 000, в то время как при пермиссивной температуре данный белок фосфорилировался. Не происходит его фосфорилирование в клетках, трансформированных SV40 и вирусом полиомы, а также химическими канцерогенами. Показано, что фосфорилирование этого белка подавляется кроличьей антисывороткой к pp60src [Kobayashi N. et al, 1981].
Установлено также, что фосфорилирование белка зависит от присутствия продукта онкогена src.
Существенно, что с этим белком ассоциирована активность малатдегидрогеназы — одного из ферментов гликолиза, локализующегося в цитозольной фракции клеток [Rubsamen Н. et al, 1982]. Однако эти данные не были подтверждены S. A. Courtneige и соавт. (1983). Итак, белок с молекулярной массой 36 000 синтезируется в цитоплазме клеток и выявляется в ретикулуме на внутренней поверхности цитоплазматических мембран, возможно в ассоциации с белками цитоскелета [Radke К. et al., 1983].
Внутриклеточное распределение этого белка не зависит от его фосфорилирования и от трансформации клеток [Courtneige S. A. et al, 1983]. Вместе с тем полагают, что фосфорилирование данного полипептида, являющегося субстратом для проявления активности рр60src-протеинкиназы, локализованной во фракции клеточных мембран, может быть важным этапом в процессе трансформации клеток RSV [Amini S, Kaji А, 1983].
Выявлено еще три гликолитических фермента (энолаза, ММ 46 000, фосфоглицератмутаза, ММ 28 000; лактатдегидрогеназа — изоформа М, локализованные в цитоплазме), которые фосфорилируются по тирозину в клетках, трансформированных RSV [Cooper J. et al, 1983].
Идентифицирован еще один клеточный субстрат — белок с молекулярной массой 39 000 — для pp60src-тиpoзинпротеинкиназы, частично связанный с плазматической мембраной и присутствующий не во всех тканях у кур. Функция этого белка не установлена [Cooper J. et al, 1983].
«Онкогены и канцерогенез», А.И.Агеенко
